飼料添加劑膽汁酸主成分

示差折光法VS熒光法

根據對飼料添加劑中豬膽酸（HCA）、豬去氧膽酸（HDCA）和鵝去氧膽酸（CDCA）的檢測方法研究，HPLC-RID（示差折光檢測法）和HPLC-FLD（熒光檢測法）是目前較為準確的兩種分析方法。兩者均是基于高效液相色譜儀搭配不同的檢測器，其檢測原理、前處置、回收率、相對標準偏差等存在很大差異，見表1。

表1.高效液相色譜-示差折光法VS高效液相色譜-熒光法[1]

1平均回收率：回收率是檢測方法的“試金石”——它用客觀數據回答了一個關鍵問題：你測到的數值，有多少是真實存在的？

高回收率（90–110%）

準確性可靠：方法能真實反映樣本中目標物含量，受基質干擾小；

前處理有效：提取、純化步驟未造成目標物損失或污染；

系統誤差可控：儀器校準、操作規范符合要求。

低回收率（＜80% ）

存在負偏差：目標物被吸附、降解或提取不完全。

2相對標準偏差RSD：是衡量檢測數據精密度（Precision） 的核心指標，其數值直接反映重復檢測結果的離散程度（波動性）。相對標準偏差（RSD）數值越小越代表“重復檢測的一致性”，精密度越高。

為什么熒光法需要對膽汁酸進行衍生而示差折光法不需要？

因為兩種檢測器的檢測原理不同。

熒光法：膽汁酸分子不存在共軛結構和發色基團，導致其在紫外-可見光譜范圍內沒有熒光吸收特性。用熒光檢測器法分離測定前，膽汁酸必須經化學衍生后引入顯色官能團轉變成相應的衍生物，才可在特定波長下顯色。簡單說就是采用衍生法使膽汁酸帶有熒光發色基團，再采用高效液相色譜法對衍生產物進行檢測。因柱前衍生步驟較多、操作復雜、衍生過程易受產品中其他物質（如載體）的影響，導致衍生反應不穩定、反應不充分、產生多種衍生化產物、色譜分離困難等問題。結果影響因素較多，對操作人員要求較高，檢測結果重復性和再現性差；而且因前處置復雜導致檢測時間長，無法連續檢測多個樣品，檢測效率低。

示差折光法：而示差檢測器通過連續檢測樣品流路與參比流路間液體折光指數差值來進行檢測；不同的膽汁酸分子結構不同，在特定光源下，具有不同的折射率。樣品經簡單處置后即可進樣檢測，檢測時間短，可連續檢測多個樣品（15個樣品/工作日）。但流動相的流速波動會影響折射率，所以不適合梯度洗脫；同時示差檢測器檢測下限約為10-5g/mL至10-7g/mL，不適用于痕量檢測（含量在百萬分之一以下稱為痕量）。但由于飼料添加劑膽汁酸含量較高，HPLC-RID的檢出限完全可以滿足飼用膽汁酸主成分含量的檢測需要。

示差折光法（HPLC-RID）VS熒光法（HPLC-FLD）實測結果對比[1]

如表 2-4所示。結果表明，4個樣品中3種膽汁酸含量測定結果示差法均較熒光法法高。這可能是因為熒光法需要皂化、衍生后進行HPLC測定，皂化、衍生過程易產生損失，方法回收率、重復性均較示差法低，使其最終總含量略低于 示差法。其次熒光法HPLC-FLD法衍生過程中易受載體基質等影響，造成膽汁酸衍生反應不穩定、衍生效果不穩定，最終導致3種膽汁酸響應值不穩定，特別容易引起批間測定結果差別大，方法重復性和再現性差。而示差折光法HPLC-RID 前處理非常簡單，僅需要用流動相提取后直接進行HPLC分析，方法穩定性好，非常適合混合型飼料添加劑中的豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量測定。

參考文獻

[1]聶倩倩.膽汁酸在動物養殖應用中的檢測方法構建[D].上海海洋大學,2024.DOI:10.27314/d.cnki.gsscu.2024.000587.

[2]Azer S A, Hasanato R. Use of bile acids as potential markers of liver dysfunction in humans: a systematic review[J]. Medicine, 2021, 100(41): e27464.

[3]Liu Y, Rong Z, Xiang D, et al. Detection technologies and metabolic profiling of bile acids: a comprehensive review[J]. Lipids in health and disease, 2018, 17(1): 121.