飼料添加劑膽汁酸主成分

示差折光法VS熒光法

根據(jù)對飼料添加劑中豬膽酸（HCA）、豬去氧膽酸（HDCA）和鵝去氧膽酸（CDCA）的檢測方法研究，HPLC-RID（示差折光檢測法）和HPLC-FLD（熒光檢測法）是目前較為準(zhǔn)確的兩種分析方法。兩者均是基于高效液相色譜儀搭配不同的檢測器，其檢測原理、前處置、回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差等存在很大差異，見表1。

表1.高效液相色譜-示差折光法VS高效液相色譜-熒光法[1]

1平均回收率：回收率是檢測方法的“試金石”——它用客觀數(shù)據(jù)回答了一個(gè)關(guān)鍵問題：你測到的數(shù)值，有多少是真實(shí)存在的？

高回收率（90–110%）

準(zhǔn)確性可靠：方法能真實(shí)反映樣本中目標(biāo)物含量，受基質(zhì)干擾??；

前處理有效：提取、純化步驟未造成目標(biāo)物損失或污染；

系統(tǒng)誤差可控：儀器校準(zhǔn)、操作規(guī)范符合要求。

低回收率（＜80% ）

存在負(fù)偏差：目標(biāo)物被吸附、降解或提取不完全。

2相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD：是衡量檢測數(shù)據(jù)精密度（Precision） 的核心指標(biāo)，其數(shù)值直接反映重復(fù)檢測結(jié)果的離散程度（波動(dòng)性）。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）數(shù)值越小越代表“重復(fù)檢測的一致性”，精密度越高。

為什么熒光法需要對膽汁酸進(jìn)行衍生而示差折光法不需要？

因?yàn)閮煞N檢測器的檢測原理不同。

熒光法：膽汁酸分子不存在共軛結(jié)構(gòu)和發(fā)色基團(tuán)，導(dǎo)致其在紫外-可見光譜范圍內(nèi)沒有熒光吸收特性。用熒光檢測器法分離測定前，膽汁酸必須經(jīng)化學(xué)衍生后引入顯色官能團(tuán)轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的衍生物，才可在特定波長下顯色。簡單說就是采用衍生法使膽汁酸帶有熒光發(fā)色基團(tuán)，再采用高效液相色譜法對衍生產(chǎn)物進(jìn)行檢測。因柱前衍生步驟較多、操作復(fù)雜、衍生過程易受產(chǎn)品中其他物質(zhì)（如載體）的影響，導(dǎo)致衍生反應(yīng)不穩(wěn)定、反應(yīng)不充分、產(chǎn)生多種衍生化產(chǎn)物、色譜分離困難等問題。結(jié)果影響因素較多，對操作人員要求較高，檢測結(jié)果重復(fù)性和再現(xiàn)性差；而且因前處置復(fù)雜導(dǎo)致檢測時(shí)間長，無法連續(xù)檢測多個(gè)樣品，檢測效率低。

示差折光法：而示差檢測器通過連續(xù)檢測樣品流路與參比流路間液體折光指數(shù)差值來進(jìn)行檢測；不同的膽汁酸分子結(jié)構(gòu)不同，在特定光源下，具有不同的折射率。樣品經(jīng)簡單處置后即可進(jìn)樣檢測，檢測時(shí)間短，可連續(xù)檢測多個(gè)樣品（15個(gè)樣品/工作日）。但流動(dòng)相的流速波動(dòng)會(huì)影響折射率，所以不適合梯度洗脫；同時(shí)示差檢測器檢測下限約為10-5g/mL至10-7g/mL，不適用于痕量檢測（含量在百萬分之一以下稱為痕量）。但由于飼料添加劑膽汁酸含量較高，HPLC-RID的檢出限完全可以滿足飼用膽汁酸主成分含量的檢測需要。

示差折光法（HPLC-RID）VS熒光法（HPLC-FLD）實(shí)測結(jié)果對比[1]

如表 2-4所示。結(jié)果表明，4個(gè)樣品中3種膽汁酸含量測定結(jié)果示差法均較熒光法法高。這可能是因?yàn)闊晒夥ㄐ枰砘?、衍生后進(jìn)行HPLC測定，皂化、衍生過程易產(chǎn)生損失，方法回收率、重復(fù)性均較示差法低，使其最終總含量略低于 示差法。其次熒光法HPLC-FLD法衍生過程中易受載體基質(zhì)等影響，造成膽汁酸衍生反應(yīng)不穩(wěn)定、衍生效果不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致3種膽汁酸響應(yīng)值不穩(wěn)定，特別容易引起批間測定結(jié)果差別大，方法重復(fù)性和再現(xiàn)性差。而示差折光法HPLC-RID 前處理非常簡單，僅需要用流動(dòng)相提取后直接進(jìn)行HPLC分析，方法穩(wěn)定性好，非常適合混合型飼料添加劑中的豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量測定。

參考文獻(xiàn)

[1]聶倩倩.膽汁酸在動(dòng)物養(yǎng)殖應(yīng)用中的檢測方法構(gòu)建[D].上海海洋大學(xué),2024.DOI:10.27314/d.cnki.gsscu.2024.000587.

[2]Azer S A, Hasanato R. Use of bile acids as potential markers of liver dysfunction in humans: a systematic review[J]. Medicine, 2021, 100(41): e27464.

[3]Liu Y, Rong Z, Xiang D, et al. Detection technologies and metabolic profiling of bile acids: a comprehensive review[J]. Lipids in health and disease, 2018, 17(1): 121.